實時熒光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，qPCR）是一種能夠?qū)崟r檢測PCR反應(yīng)進(jìn)程的技術(shù)，其檢測原理主要包括PCR擴(kuò)增、熒光探針檢測和數(shù)據(jù)分析三個關(guān)鍵步驟。

首先，PCR擴(kuò)增階段：在PCR反應(yīng)中，引物（primer）會與待檢測DNA模板的特定序列結(jié)合，然后通過熱循環(huán)的方式進(jìn)行擴(kuò)增，分為三步循環(huán)：變性、退火和延伸。在變性步驟中，PCR反應(yīng)混合物被加熱至95°C，使DNA雙鏈分子解旋成兩條單鏈。在退火步驟中，反應(yīng)混合物被冷卻至適當(dāng)?shù)臏囟?，使引物與待檢測DNA模板上相應(yīng)的序列結(jié)合。在延伸步驟中，DNA聚合酶能夠在適當(dāng)?shù)臏囟认潞铣尚碌腄NA鏈。通過不斷重復(fù)這三個步驟，可實現(xiàn)目標(biāo)序列的多次擴(kuò)增。

其次，熒光探針檢測階段：在實時熒光定量PCR中，引入了熒光探針來實時監(jiān)測PCR反應(yīng)的進(jìn)程。熒光探針是一種含有熒光分子和熒光淬滅分子的寡核苷酸探針，與PCR引物及DNA模板中的目標(biāo)序列互補(bǔ)。當(dāng)熒光探針與目標(biāo)序列結(jié)合時，熒光淬滅分子與熒光分子之間的距離較近，導(dǎo)致熒光信號被淬滅；當(dāng)PCR反應(yīng)進(jìn)行到延伸步驟時，熒光探針被DNA聚合酶附加在目標(biāo)序列上，使熒光信號被釋放出來。因此，熒光信號的強(qiáng)度與PCR反應(yīng)的進(jìn)程成正比，可以用來實時檢測PCR反應(yīng)中目標(biāo)序列的數(shù)量。

最后，數(shù)據(jù)分析階段：實時熒光定量PCR儀會實時監(jiān)測PCR反應(yīng)中熒光信號的強(qiáng)度，并將其轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號進(jìn)行記錄。通過在PCR反應(yīng)的不同循環(huán)次數(shù)時記錄熒光信號的強(qiáng)度，可以繪制出PCR擴(kuò)增曲線，從而確定目標(biāo)序列的起始量。同時，結(jié)合對照組的擴(kuò)增曲線，可以計算出待檢測樣本中目標(biāo)序列的相對量化值，以實現(xiàn)對目標(biāo)序列數(shù)量的定量分析。

總的來說，實時熒光定量PCR通過引入熒光探針監(jiān)測PCR反應(yīng)的進(jìn)程，結(jié)合數(shù)據(jù)分析，可以實現(xiàn)對目標(biāo)序列的準(zhǔn)確、快速、高靈敏度的定量檢測，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)分析、病原微生物檢測、基因突變檢測等領(lǐng)域。