產(chǎn)品組成

　　產(chǎn)品簡介

　　基于重組原理的無縫克隆技術(shù)，作為新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、連接步驟，也不需要末端補平等操作，依據(jù) DNA 片段與線性化載體末端的 15~25 nt 同源序列的重組，可將插入片段克隆至任意線性載體的任意位點，載體自連背景極低，是一種簡單、快速、 高效的 DNA 定向克隆技術(shù)。 LightNing? DNA Assembly Mix 無縫克隆試劑盒最快僅需 5 分鐘即可完成單片段重組，且陽性率高于 95%。Mix 中添加的輔助因子， 有效提高克隆陽性率;經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系，能夠一定程度上耐受未純 化 PCR 產(chǎn)物中含有的雜質(zhì)。升級版的無縫克隆試劑盒具有更高的陽性率、更好的兼容性。

　　實驗步驟

　　1. 實驗流程概要

　　設(shè)計與相鄰片段末端具有重疊序列的擴增引物;準備載體;酶切或反向PCR擴增;50℃反應(yīng)5~15min;轉(zhuǎn)化感受態(tài)

　　2.線性化克隆載體制備

　　選擇合適的克隆位點，對載體進行線性化，載體的線性化可以通過酶切或反向 PCR 擴增完成。

　　① 酶切制備 推薦使用 LightNing? 快速內(nèi)切酶進行雙酶切，使載體線性化完 全，以降低轉(zhuǎn)化背景 ( 假陽性克隆 );若使用單酶切進行線性化，可以適當(dāng)延長酶切時間以減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。 注 1：經(jīng)雙酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，經(jīng)單酶切則需要去磷酸化; 注 2：酶切完成后，應(yīng)將快速內(nèi)切酶失活或?qū)δ康漠a(chǎn)物純化后再用于重組反應(yīng)。

　?、?反向 PCR 擴增制備 為減少擴增突變的引入，推薦使用高保真 PCR Mix 進行擴增。推 薦使用預(yù)線性化質(zhì)粒作為模板，以減少環(huán)狀質(zhì)粒模板殘留對克隆陽性 率的影響。

　　3. 插入片段 PCR 引物設(shè)計 PCR 引物的 5' 端必須包含與其相鄰片段(插入片段或載體)末端 同源的 15~25 nt(推薦 18 nt)序列。假如載體為粘性末端，且 3' 端 突出，則引物設(shè)計必須包含突出部分;若 5' 端突出，則引物設(shè)計可以 包含突出部分，也可以不包含。 插入片段正向擴增引物： 5'—上游載體末端同源序列 + 酶切位點(可選)+ 基因特異性正向 擴增序列— 3' 插入片段反向擴增引物： 3'—基因特異性反向擴增序列 + 酶切位點(可選)+ 下游載體末端 同源序列—5' 注 1：盡量選擇無重復(fù)序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進行克隆，當(dāng)載體克隆位點上下游 25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為 40%~60% 時，重組效率最高;

　　注 2：本試劑盒所提供的 pUC 19 載體(Ampr )連接端序列如下：

　　4. 插入片段的 PCR 擴增 推薦使用高保真 PCR Mix 進行擴增，以減少擴增突變的引入。建 議使用純化后的 PCR 產(chǎn)物進行無縫克隆反應(yīng)，若 PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳鑒定為特異性擴增產(chǎn)物，可直接使用，但加樣體積不應(yīng)超過 總反應(yīng)體積的 20%。

　　5. 重組反應(yīng)

　?、?于冰水浴中配置以下反應(yīng)體系：

　　a. 最適載體用量 (ng) = 0.02 × 載體堿基對數(shù)，即 0.03 pmol。 b. 插入單片段，最適片段用量(ng)= 0.04 × 片段堿基對數(shù)。

　　注 1：若插入單片段的長度大于載體，則應(yīng)互換載體與插入片段用量;

　　注 2：若插入片段的長度小于 200 bp，則插入片段應(yīng)使用 5 倍載體用量;

　　注 3：若按上述公式計算得到的用量超過最低 / 最高值，則建議直接按最低 / 最高用 量使用;

　　注 4：載體片段過長、插入片段過長克隆陽性率均會降低。 重組反應(yīng)體系配制完成后，用移液槍輕輕吸打混勻各組分，避免 產(chǎn)生氣泡，切勿渦旋。

　?、?將反應(yīng)體系置于 50℃，反應(yīng) 5~15 min。 注 1：推薦使用 PCR 儀等溫控比較精準的儀器進行反應(yīng)，反應(yīng)時間不足或太 長克 隆效率均會降低; 注 2：當(dāng)載體骨架在 10 kb 以上或插入片段在 4 kb 以上時，建議延長反應(yīng)時間到 15~30 min; 注 3：50℃反應(yīng)完成后，建議進行瞬時離心，將反應(yīng)液收集至管底。

　?、?將反應(yīng)液離心管置于冰上冷卻，之后進行轉(zhuǎn)化或者儲存于 -20℃。 注 1： -20℃儲存的重組產(chǎn)物，建議在 1 周內(nèi)使用。

　　6. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化 取 5~10 μl 反應(yīng)液，加入到 100 μl 感受態(tài)細胞中，緩慢吸打混 勻，冰上放置 30 min。42℃ 熱激 45~60 sec，冰浴 5 min。加 500 μl SOC 或 LB 培養(yǎng)基，37℃ 振蕩培養(yǎng) 40~60 min(200 rpm)。將 菌液均勻涂布在含有對應(yīng)抗生素的平板上，倒置于 37℃ 過夜培養(yǎng)。

　　注 1：不同感受態(tài)細胞最后的克隆陽性率會有所差別，推薦使用轉(zhuǎn)化效率 > 108 CFU/ μg 的感受態(tài)細胞;

　　注 2：菌落數(shù)取決于 PCR 產(chǎn)物與線性化載體的數(shù)量和純度;

　　注 3：陽性對照平板通常生長大量白色單菌落，陰性對照平板只生長很少的菌落。

　　7. 陽性克隆檢測：挑取單菌落至 10 μl ddH2O 中混勻，95℃裂解 10 min 后，取 1 μl 裂解液作為模板，進行菌落 PCR 鑒定，或?qū)尉浣臃N至抗性培養(yǎng) 基中培養(yǎng)過夜后，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定。

　　注 1：菌落 PCR 時建議至少使用一條通用引物，避免假陽性結(jié)果;

　　注 2：必要時可進一步對陽性結(jié)果進行測序鑒定。

　　常見問題

　　儲存溫度:   -20°C儲存

　　品       牌:   三獅生物

EZ22046S-LightSpeed系列  DNA Assembly Mix Plus.pdf