質(zhì)粒小提試劑盒

（離心柱型）

貨號(hào)：DP001         規(guī)格：100T/200T      保存：室溫（RNase A -20℃保存）

產(chǎn)品說(shuō)明：

本試劑盒采用堿裂解法裂解細(xì)胞，根據(jù)離心吸附柱在高鹽狀態(tài)下特異性結(jié)合溶液中DNA的原理特異性提取質(zhì)粒DNA。離心吸附柱中采用的硅基質(zhì)材料能高效、專(zhuān)一的吸附DNA，可最大限度去除雜質(zhì)蛋白及細(xì)胞中其他有機(jī)化合物。使用本試劑盒提取的質(zhì)粒DNA可適用于各種常規(guī)操作，包括酶切、PCR、測(cè)序、連接和轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)。

產(chǎn)品組成：

儲(chǔ)存條件：

該試劑盒置于室溫（15-25℃）干燥條件下，可保存12個(gè)月。RNase A -20℃長(zhǎng)期保存，2-8℃可穩(wěn)定保存。若溶液產(chǎn)生沉淀，可在37℃水浴中預(yù)熱10min，以溶解沉淀。溶液Ⅰ在使用前先加入RNaseA（將試劑盒中提供的RNaseA全部加入），混勻，置于2-8℃保存。單獨(dú)包裝的RNase A -20℃穩(wěn)定保存12個(gè)月以上。

使用前請(qǐng)先在漂洗液中加入無(wú)水乙醇，加入體積請(qǐng)參照瓶體上的標(biāo)簽。如非指明，所有離心步驟均為使用臺(tái)式離心機(jī)在室溫下離心。

操作步驟：

1. 取1-5mL細(xì)菌培養(yǎng)物，12000rpm離心1min，盡量吸除上清（菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中）。

2. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250μL溶液Ⅰ（請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A），使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。注意：如果菌塊未徹底混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低。

3. 向離心管中加入250μL溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和，以免打斷細(xì)菌基因組DNA進(jìn)而造成污染，此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮黏稠，作用時(shí)間不要超過(guò)5min，以免質(zhì)粒受到破壞。

4. 向離心管中加入350μL溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min，用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。

5. 將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

6. 向吸附柱中加入700μL漂洗液（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。

7. 向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000rpm離心1min，棄廢液，將吸附柱放回收集管。

8. 12000rpm離心2min，將吸附柱敞口置于室溫放置數(shù)分鐘，目的是去除吸附柱中殘余的漂洗液，否則漂洗液中的乙醇會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如酶切、PCR等。

9. 將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加50-200μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，室溫放置2min，12000rpm離心1min。

10. 為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心1min。提取獲得的質(zhì)粒DNA經(jīng)濃度及純度檢測(cè)后于-20℃保存。

注意事項(xiàng)（在使用本試劑盒前請(qǐng)閱讀此注意事項(xiàng)）：

1. 使用前請(qǐng)先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現(xiàn)混濁，如有混濁現(xiàn)象，可經(jīng)37℃水浴，待溶液恢復(fù)澄清后再使用。溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和漂洗液使用時(shí)避免直接接觸，后應(yīng)立即擰緊蓋子。

2. 洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于50μL，體積過(guò)小影響回收效率；洗脫液的pH值對(duì)洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在8.0左右（可用NaOH將水的pH值調(diào)至此范圍），pH值低于7.0會(huì)降低洗脫效率，提取產(chǎn)物應(yīng)保存在-20℃，以防降解。

3. 如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)?；虼笥?/span>10kb的大質(zhì)粒，應(yīng)加大菌體使用量，使用5-10mL過(guò)夜培養(yǎng)物，同時(shí)按照比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時(shí)可以適當(dāng)?shù)?/span>延長(zhǎng)時(shí)間，以增加提取效率。

4. 濃度及純度檢測(cè)：得到的質(zhì)粒DNA純度可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，其與樣品保存時(shí)間、操作過(guò)程中的剪切力等因素有關(guān)。DNA應(yīng)在OD260處有顯著吸收峰，OD260值為1相當(dāng)于大約50μg/mL雙鏈DNA、40μg/mL單鏈DNA。OD260/OD280比值應(yīng)為1.7-1.9，如果洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)?/span>pH值和離子存在會(huì)影響吸光值，但并不表示純度低。

DP001三獅質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)2201-A.pdf