瓊脂糖凝膠電泳后存在非特異性擴(kuò)增條帶是為什么

2022-01-06 13:42:23

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主要表現(xiàn)：Marker正常，但檢測樣本條帶與預(yù)期條帶大小不一致或存在非特異性擴(kuò)增條帶。

原因分析：

1. 引物設(shè)計問題：存在引物二聚體或二級結(jié)構(gòu)，引物特異性較差。

2. 反應(yīng)體系酶或Mg2+過量：檢測體系中酶或Mg2+過量，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

3. 模板濃度過高：樣本核酸濃度過高，不同長度的模板片段會導(dǎo)致一些非目標(biāo)條帶的擴(kuò)增。

4. 引物濃度過高：過高濃度的引物可能與體系中的Mg2+結(jié)合影響酶活性，或產(chǎn)生引物二聚體。

5. 反應(yīng)條件不合適：PCR過程中退火溫度偏低，反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)過多，均會產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增。

解決方案：

1. 重新設(shè)計引物，避免引物二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，或者采用巢式PCR對目標(biāo)片段進(jìn)行擴(kuò)增。

2. 優(yōu)化反應(yīng)體系（預(yù)混體系除外），適當(dāng)降低體系中的Mg2+濃度及酶的用量。

3. 將樣本核酸模板稀釋以后再上樣，注意稀釋過程要輕柔，避免核酸氣溶膠污染。

4. 優(yōu)化反應(yīng)體系，適當(dāng)降低引物用量（終濃度），可通過引物梯度用量確定佳引物濃度。

5. 優(yōu)化反應(yīng)條件，適當(dāng)提高退火溫度，或使用二階段溫度法，適當(dāng)減少反應(yīng)循環(huán)數(shù)。

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