1.熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中無(wú)Ct值出現(xiàn)

（1）序列或者引物有誤：檢測(cè)樣品中不含有待檢測(cè)基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)仔細(xì)查找待檢測(cè)基因序列，重新重新設(shè)計(jì)引物。

（2）核酸模板降解：避免核酸樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況，在操作過(guò)程中使用的離心管、吸頭等耗材均為一次性。

（3）核酸模板量不足：對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的高濃度做起，但要注意高濃度核酸會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增及氣溶膠污染。

（4）反應(yīng)的循環(huán)數(shù)不夠：熒光定量PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一般在35個(gè)循環(huán)以上，但是過(guò)多的循環(huán)次數(shù)可增加背景值（建議不超過(guò)45個(gè)循環(huán)）。

（5）引物或探針降解：可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性，若是電泳條帶呈彌散狀，可考慮重新合成引物或探針，建議使用前進(jìn)行分裝。

（6）檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤：熒光定量PCR一般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行信號(hào)采集，如采集步驟有誤會(huì)導(dǎo)致結(jié)果無(wú)法準(zhǔn)確判讀。

2.熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中Ct值出現(xiàn)過(guò)晚

原因分析與解決方案：

（1）擴(kuò)增產(chǎn)物太長(zhǎng)：一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度，長(zhǎng)于200bp的片段建議采用三步法擴(kuò)增。

（2）檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜：檢測(cè)基因包含高GC、復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)片段等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，都會(huì)影響PCR擴(kuò)增。

（3）擴(kuò)增效率低：優(yōu)化反應(yīng)條件，重新設(shè)計(jì)引物或探針，熒光染料存在降解，體系中存在抑  制物，改用三步法進(jìn)行反應(yīng)等。

（4）模版降解或模版濃度太高：通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性，若模板存在降解則重新提取核酸模板，若濃度太高則進(jìn)行稀釋。

（5）試劑靈敏度不好：試劑（尤其是預(yù)混液）檢測(cè)性能不好，靈敏度低、抗干擾能力差，建議更換更高靈敏度、更強(qiáng)抗干擾的試劑。