熱啟動(dòng)Taq酶的原理

在PCR的發(fā)展歷史中，熱啟動(dòng)酶的探索發(fā)現(xiàn)是制約PCR發(fā)展的重要因素，被運(yùn)用到PCR中的酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段，Klenow酶每次循環(huán)都需重新加入，過(guò)程繁瑣。此后，科學(xué)家成功的從水生嗜熱桿菌中提取出耐熱的DNA聚合酶，該酶在90℃下反應(yīng)2小時(shí)仍具有70%的活性，這就避免每次循環(huán)重新加酶的過(guò)程，提高了擴(kuò)增效率，因此被廣泛運(yùn)用到PCR擴(kuò)增中。

溫度對(duì)酶活性的影響表現(xiàn)為雙重作用，高溫失活，低溫抑 制。普通的Taq DNA聚合酶的適溫度是72℃，此時(shí)酶的活性佳，小于此溫度，酶有較弱活性。這樣，在PCR擴(kuò)增由低溫上升至高溫的過(guò)程中（也就是溫度達(dá)到變性溫度時(shí)）酶發(fā)揮較弱的活性，體系極易錯(cuò)配或形成引物二聚體，尤其是當(dāng)設(shè)計(jì)的引物3’端是G或C，錯(cuò)配的鏈很難重新解開(kāi)。因此要提高PCR擴(kuò)增的特異性和降低反應(yīng)錯(cuò)配率，可以人為的控制酶的活性，在72℃之前讓酶不發(fā)揮活性，這樣就避免了在升溫過(guò)程中（或配置反應(yīng)體系）發(fā)生鏈的錯(cuò)配，從而保證擴(kuò)增的特異性。Relia熱啟動(dòng)酶就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中 心：低溫下化學(xué)小分子和酶活性中 心結(jié)合，酶無(wú)活性，溫度升高至95℃，兩者脫離，酶活性中 心暴露，開(kāi)始指導(dǎo)體系擴(kuò)增，大的提高擴(kuò)增的特異性和靈敏度。與抗體封閉的酶相比，化學(xué)修飾的酶活性維持更加穩(wěn)定（抗體封閉是一種動(dòng)態(tài)平衡）且無(wú)任何外源DNA污染。