實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的簡(jiǎn)介

自從PCR技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，隨著技術(shù)的推廣和應(yīng)用，派生了許多適用于不同目的的改良方法和技術(shù)，如模板為RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcriptase PCR，RT-PCR）；能同時(shí)檢測(cè)不同目的基因的多重PCR（multiplex PCR）；能提高擴(kuò)增反應(yīng)的敏感性和特異性的巢式PCR（nested PCR）；通過(guò)檢測(cè)熒光素、或同位素、或酶活性來(lái)顯示目的片段存在的標(biāo)記引物PCR（Labeled Primers PCR）；將抗原抗體的特異性反應(yīng)與PCR技術(shù)結(jié)合起來(lái)，以檢測(cè)微量蛋白質(zhì)的免疫PCR（IM-PCR）以及能對(duì)待測(cè)模板定量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR等等。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR體系中加入熒光基團(tuán)，使PCR產(chǎn)物和熒光相關(guān)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且整個(gè)PCR過(guò)程可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，且耗時(shí)短，操作方便，不易污染。

一、定量原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是利用熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

1．?dāng)U增曲線

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)程中，通過(guò)熒光定量PCR儀，在PCR每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集，以熒光強(qiáng)度為縱軸，循環(huán)次數(shù)為橫軸，所得到的曲線稱為PCR的擴(kuò)增曲線。

2．熒光閾值

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的前面十多個(gè)循環(huán)，熒光強(qiáng)度變化不大，熒光強(qiáng)度的平均值可稱為基線值，在基線值的基礎(chǔ)上，增加一定數(shù)量后得到一熒光值，這一點(diǎn)后，隨著循環(huán)次數(shù)的增加，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，因此稱該值為熒光閾值。一般取PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)。

3．Ct值與標(biāo)準(zhǔn)曲線

Ct值是指PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ct值與反應(yīng)管內(nèi)的模板數(shù)密切相關(guān)，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。

二、分類與工作原理

根據(jù)引入熒光標(biāo)記的類型，常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR有以下幾種：SYBR Green法、水解探針?lè)ǎ═aqMan法）、分子信標(biāo)法等。