實(shí)時熒光定量PCR是一種用于定量PCR反應(yīng)的技術(shù)，其核心是使用熒光探針來監(jiān)測反應(yīng)過程中產(chǎn)生的熒光信號。該技術(shù)在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等方面具有廣泛的應(yīng)用。

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)主要包括以下幾個方面：

1. 可靠的熒光探針設(shè)計(jì)：熒光探針選擇的好壞直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。熒光探針必須與目標(biāo)序列特異性結(jié)合，不能與模板之外的序列結(jié)合，否則測定的PCR產(chǎn)物濃度將被高估。

2. 穩(wěn)定、高靈敏熒光檢測系統(tǒng)：實(shí)時PCR實(shí)驗(yàn)依靠精確的熒光檢測系統(tǒng)，熒光的強(qiáng)度取決于熒光染料的濃度及PCR產(chǎn)物量的多寡。呈線性增加，欲得到準(zhǔn)確的PCR產(chǎn)物量就必須確保熒光染料不能受到化學(xué)或物理因素的影響降解或失去熒光性能。

3. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線即以所測熒光值為縱坐標(biāo)，PCR產(chǎn)物的濃度為橫坐標(biāo)，作出一條從北京>直線，即PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。該曲線可用于計(jì)算未知樣本中PCR產(chǎn)物的濃度。

4. 優(yōu)化反應(yīng)條件：PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化對PCR產(chǎn)物的生成、熒光信號的強(qiáng)度及標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率等都有影響。因此，在PCR反應(yīng)過程中，應(yīng)該認(rèn)真觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)的情況調(diào)整PCR反應(yīng)條件。

實(shí)時熒光定量PCR的操作步驟

1. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：包括熒光探針的設(shè)計(jì)、熒光強(qiáng)度檢測系統(tǒng)的選擇等。

2. 樣本制備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，從樣品中提取DNA、RNA等所需的分子，純化后進(jìn)行定量。

3. 反應(yīng)體系準(zhǔn)備：依據(jù)實(shí)驗(yàn)所需，在反應(yīng)管組裝PCR反應(yīng)體系，包括不同的PCR緩沖液、MgCl2、引物、熒光探針、穩(wěn)定酶、被測樣品等。

4. 實(shí)時PCR反應(yīng)：通過PCR儀器進(jìn)行實(shí)時PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件可根據(jù)不同的引物和熒光探針進(jìn)行調(diào)整。

5. 數(shù)據(jù)分析：通過實(shí)時PCR儀器測量PCR反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，并通過熒光信號的大小計(jì)算PCR產(chǎn)物濃度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線等。