實時熒光定量PCR儀  實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)作為當前常用的分子生物學檢測技術(shù)之一，被廣泛應(yīng)用于基因表達分析、病原體檢測、遺傳譜分析、體外診斷等領(lǐng)域。而實時熒光定量PCR儀則是qPCR技術(shù)的核心設(shè)備之一，其可以實現(xiàn)熒光信號的實時監(jiān)測和定量分析，在qPCR技術(shù)中的應(yīng)用已經(jīng)越來越廣泛。本文將著重介紹實時熒光定量PCR儀的技術(shù)原理。

實時熒光定量PCR（Real-time qPCR）是一種可實時監(jiān)測DNA擴增過程的方法，在PCR反應(yīng)過程中通過連續(xù)測量放大產(chǎn)物的信號強度，從而記錄擴增所需的周期數(shù)。熒光染料是實時PCR檢測過程中的核心之一，熒光信號與PCR反應(yīng)產(chǎn)物的濃度成正比例，并且熒光信號可以直接反應(yīng)出PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性、數(shù)量、擴增效率以及靶標轉(zhuǎn)錄水平等信息。實時PCR技術(shù)的核心在于連續(xù)監(jiān)測PCR反應(yīng)體系中熒光信號的變化。實時熒光定量PCR儀通過實時監(jiān)測反應(yīng)體系中熒光染料的熒光強度，并根據(jù)事先測定或設(shè)定的標準曲線，將樣品中得到的相應(yīng)熒光值轉(zhuǎn)化為相應(yīng)模板分子數(shù)量，從而實現(xiàn)精 確分析熒光信號的定量PCR分析。

實時熒光定量PCR主要分為兩種方法：熔解曲線分析法和絕 對定量分析法。熔解曲線分析法是通過不斷升溫的方式觀察PCR產(chǎn)物的融解曲線來區(qū)分PCR產(chǎn)物的特異性，終確定PCR反應(yīng)體系中存在的DNA序列；而絕 對定量分析法是通過制備熒光標準曲線，再將待測樣品熒光強度值代入標準曲線中計算出目標DNA的絕 對數(shù)量。

實時熒光定量PCR儀主要包括以下幾個核心部分：

光源系統(tǒng)：實時熒光定量PCR儀主要采用激光二 極管（LED）或者高壓汞燈等高效光源來提供激發(fā)熒光染料所需的光源，不同熒光染料在不同波長下的熒光特性也不同，所需的激光波長也會不同。因此，實時PCR儀需要根據(jù)熒光染料的種類選擇不同波長的LED或者燈，以便精 確激發(fā)熒光染料的熒光信號。

激光掃描系統(tǒng)：實時PCR儀通過激光掃描熒光光源提高檢測精度和靈敏度，同時采用光學濾鏡區(qū)分與標記熒光染料的信號，提高熒光檢測的精度和準確性。

溫度控制系統(tǒng)：實時熒光定量PCR儀需要精 確控制溫度的變化，以便引導PCR反應(yīng)步驟的進行。常見的實時PCR反應(yīng)中，通過多次升降溫度，對完成PCR反應(yīng)進行指導。因此，實時PCR需要一個有能力控制不同溫度區(qū)間的加熱模塊。

隔熱系統(tǒng)：實時PCR反應(yīng)需要在精細的溫度控制下進行，因此必須保持反應(yīng)體系的恒定溫度，避免外部環(huán)境對反應(yīng)的影響。因此，實時PCR儀通常采用驅(qū)動空氣或者油來隔離內(nèi)外溫度環(huán)境，以保證反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

軟件系統(tǒng)：實時PCR檢測數(shù)據(jù)處理需要依托一套可靠的數(shù)據(jù)分析和處理軟件系統(tǒng)進行，包括溫度梯度生成、熒光信號采集、熒光信號定量計算等功能。

實時熒光定量PCR技術(shù)的引入，能夠準確、快速、高效地分析目標DNA水平，從而在生物醫(yī)學領(lǐng)域的精 準檢測、遺傳疾病診斷、基因療法等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用前景。隨著高通量、多維度的實時PCR技術(shù)的不斷進步，實時PCR儀的應(yīng)用將愈發(fā)成熟和廣泛。