實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的:

1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真 正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期)，此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。

2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

實時熒光定量PCR的定量方法

在Real-timePCR中，模板定量有兩種策略，相對定量和絕 對定量。

傳統(tǒng)定量PCR方法簡介

1)內(nèi)參照法:在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高 效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。

2)競爭法:選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高 效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

3)PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結合，再加入抗地高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物，酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。