認(rèn)識(shí)選擇熒光定量PCR的兩個(gè)大的誤區(qū)：

誤區(qū)一：儀器通道越多越好

隨著PCR技術(shù)的成熟運(yùn)用，多重?cái)U(kuò)增越來越熱鬧，熒光定量PCR儀也不能幸免。

在使用有些廠家5通道的熒光定量?jī)x時(shí)，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精 確性和準(zhǔn)確性都要在實(shí)驗(yàn)中使用ROX（一種熒光染料）或?qū)Ｓ玫腞eference dye，這些熒光染料都須單獨(dú)使用一個(gè)檢測(cè)通道。這樣以來，真 正能檢測(cè)多重PCR熒光信號(hào)的有效通道只有4個(gè)，而且使用校正染料可能會(huì)增加后期的使用成本。有的熒光定量PCR的檢測(cè)通道是只為自已廠家的專用的熒光染料或試劑開放的，有效檢測(cè)通道也絕非像宣傳資料中宣稱的那么多。在購(gòu)買前確認(rèn)熒光定量PCR儀器的有效檢測(cè)通道尤為重要，不能單單只聽宣傳。

考慮多重?zé)晒舛縋CR的通道數(shù)的時(shí)候也應(yīng)該從實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況出發(fā)，多重PCR并非人人適用、人人可用，因?yàn)槎嘀豍CR須要對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，在引物設(shè)計(jì)的時(shí)候就可能開始考慮能不能放在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)，不同的反應(yīng)需要的退火溫度不同，不合適的退火溫度會(huì)降低擴(kuò)增效率，放大非特異性擴(kuò)增，甚至擴(kuò)增不出來，它使實(shí)驗(yàn)指數(shù)倍的復(fù)雜化了。臨床上因?yàn)橛性噭S家專門針對(duì)某些疾病開發(fā)研制的多重檢測(cè)試劑盒，才需要用到3、4、5通道的檢測(cè)；科研用的熒光定量因?yàn)樵O(shè)計(jì)探針麻煩，基本上都用染料法，基本上單通道就能滿足。

誤區(qū)二：Real-Time PCR儀無需梯度功能

對(duì)于使用染料法的定量PCR反應(yīng)，雖然有各種各樣的PCR引物設(shè)計(jì)軟件或者經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算熔解溫度（Tm值），但運(yùn)用的公式不同、引物序列不同，Tm值的差異會(huì)很大。引物的熔解溫度決定了退火溫度。而且模版中堿基的組合千變?nèi)f化，對(duì)于特殊片斷，經(jīng)驗(yàn)公式得到的數(shù)據(jù)不一定能得出準(zhǔn)確的結(jié)果，退火溫度細(xì)微的差異對(duì)結(jié)果都可能產(chǎn)生決定性的影響，因而“摸條件”一度是讓人很頭疼的問題。梯度PCR的出現(xiàn)部分解決了一些問題——在反應(yīng)過程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出適合的反應(yīng)條件。不單退火溫度，連變性溫度和延伸溫度都可以優(yōu)化——對(duì)于多種聚合酶混合酶擴(kuò)增如Invitrogen、Clontech、Promega的多數(shù)高保真Taq酶來說這個(gè)非常重要，因?yàn)門aq和校正酶的反應(yīng)溫度可能有顯著差異，優(yōu)化延伸溫度就顯得很重要。

使用有梯度功能的熒光定量PCR可以一次完成以往多次實(shí)驗(yàn)才能完成的優(yōu)化過程，簡(jiǎn)化了摸索 PCR反應(yīng)條件的繁瑣實(shí)驗(yàn)，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間提高 效率，又節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本。臨床用戶無所謂，可以不摸索反應(yīng)條件，診斷試劑盒的說明書基本上提供的差不多，但是科研用戶注意了，一定要選擇有溫度梯度的，畢竟發(fā)文章的時(shí)候期刊要求熒光定量的數(shù)據(jù)要符合MIQE的要求，擴(kuò)增效率要夠95%-105%，不然期刊可能不認(rèn)可你的數(shù)據(jù)。