實(shí)時熒光定量PCR (qPCR)實(shí)驗(yàn)操作流程

實(shí)驗(yàn)原理：

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）指的是在PCR進(jìn)行的同時，對其過程進(jìn)行監(jiān)測的能力（即實(shí)時）。

因此，數(shù)據(jù)可在PCR擴(kuò)增過程中，而非PCR結(jié)束之后，進(jìn)行收集。這為基于PCR的DNA和RNA定量方法帶來了革命性的變革。在實(shí)時熒光定量PCR (qPCR)中，反應(yīng)以循環(huán)中首 次檢測到目標(biāo)擴(kuò)增的時間點(diǎn)為特征，而非在一定循環(huán)數(shù)后目標(biāo)分子累計(jì)的擴(kuò)增量。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高，則會越快觀察到熒光的顯著增加。相反，終點(diǎn)法檢測（也稱“讀板檢測”）測量的是PCR循環(huán)結(jié)束時累計(jì)的PCR產(chǎn)物量。

實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：

cDNA模板、引物、qPCR mix、ddH2O等。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.配樣

按照實(shí)驗(yàn)需要對cDNA模板加水作適當(dāng)稀釋，渦旋混勻后離心，根據(jù)實(shí)際所檢測樣品和基因的數(shù)量計(jì)算加樣體系，按照體系以此加入ddH2O，qPCR mix，引物，配成一管mix，渦旋混勻，后離心。準(zhǔn)備適量的qPCR八連排板或者96孔板，在這里我們用的是八連排管，置于冰上操作，將上步混勻的mix按每孔19μL加入到八連排孔中。

2.加模板

在每個孔各加入1μL的cDNA模板。加樣完畢后，蓋上八連排管蓋，注意盡量從孔邊上壓緊管蓋。渦旋混勻后離心，去除氣泡。

3.上機(jī)反應(yīng)

上機(jī)前先設(shè)置程序，具體如下：設(shè)置反應(yīng)溫度，設(shè)置孔板信息，樣品放入儀器中，開始反應(yīng)。

4.導(dǎo)出數(shù)據(jù)

反應(yīng)結(jié)束后得到qPCR數(shù)據(jù)，根據(jù)溶解曲線，查看數(shù)據(jù)的有效性，導(dǎo)出數(shù)據(jù)為EXCEL文件并保存。

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)束

實(shí)驗(yàn)完畢，打開qPCR儀，取出八連排管，蓋上qPCR儀，關(guān)閉電腦，儀器。

注意事項(xiàng)：

1.由于分裝過程中，吸頭具有表面張力，會導(dǎo)致樣品損耗，因此根據(jù)實(shí)際需要，多配一些。

2.實(shí)驗(yàn)中用移液槍時注意保持相同的力度。勻速吸打。

3.操作應(yīng)于冰上進(jìn)行，防止因操作時間過長，影響酶活性。