實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光集團(tuán)，利用熒光信號(hào)來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析。

其特點(diǎn)有：

(1)用產(chǎn)生熒光信號(hào)的指示劑顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量，進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)的熒光監(jiān)測(cè)，避免終點(diǎn)定量的不準(zhǔn)確性，并且消除了標(biāo)本和產(chǎn)物的污染，且無復(fù)雜的產(chǎn)物后續(xù)處理過程。

(2)熒光信號(hào)通過熒光染料嵌入雙鏈DNA，或熒光探針特異結(jié)合木得檢測(cè)物等方法獲得，打打提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和精 確性。Real-time O-PCR可以應(yīng)用于mRNA表達(dá)的研究、DNA拷貝數(shù)的檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性的測(cè)定、細(xì)胞因子的表達(dá)分析、腫瘤耐藥基因表達(dá)的研究以及病毒感染的定量監(jiān)測(cè)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的基本原理

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光基團(tuán)，這些熒光物質(zhì)有其特定的波長(zhǎng)。儀器可以自動(dòng)檢出，利用熒光信號(hào)積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，在PCR循環(huán)中，測(cè)量的信號(hào)將作為熒光閾值的坐標(biāo)。并且引入一個(gè)——Ct值（Threshold cycle）概念，Ct值是指產(chǎn)生可被檢測(cè)到得熒光信號(hào)所需的小循環(huán)數(shù)，是在PCR循環(huán)過程中熒光信號(hào)由本底開始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。

熒光閾值相當(dāng)于基線熒光信號(hào)的平均信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般認(rèn)為在熒光閾值以上所測(cè)出的熒光信號(hào)是一個(gè)可信的信號(hào)，可以用于定義一個(gè)樣本的Ct值。通常用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值來產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算相對(duì)方程式。

方程式的斜度可以用來檢查PCR的效率，所有標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸分析需要存在一個(gè)高相關(guān)系數(shù)（R2＞0.99），這樣才能認(rèn)為實(shí)驗(yàn)的過程和數(shù)據(jù)是可信的，使用這個(gè)方程式計(jì)算出未知樣本的初始模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀都有軟件，可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線中自動(dòng)地計(jì)算出未知樣本的初始模板量。