實時熒光定量PCR儀  Q：RT-PCR、QPCR、Real-time PCR、real-time RT-PCR有什么區(qū)別？

A：RT-PCR就是逆轉(zhuǎn)錄 PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR），是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行 DNA擴增。

Real-time-PCR和 qPCR（Quantitative Rea-ltime-PCR ）是一碼事，都是實時定量PCR，指的是PCR過程中每個循環(huán)都有數(shù)據(jù)的實時記錄，因此可以對起始模板數(shù)量進行精 確的分析。雖然Real-time PCR（實時熒光定量PCR）和 Reverse transcription PCR（反轉(zhuǎn)錄PCR）看起來都可以縮寫為RT-PCR，但是，國際上的約定俗成的是：RT-PCR特指反轉(zhuǎn)錄PCR，而Real-time PCR一般縮寫為 qPCR（quantitative real-time PCR）。而real-time RT-PCR（RT-qPCR）， 就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的反轉(zhuǎn)錄PCR：先從 RNA 反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA（RT），然后再用 Real-time PCR進行定量分析（qPCR）。

Q：為什么熒光定量PCR的擴增產(chǎn)物片段長度應(yīng)該控制在80-300bp范圍內(nèi)？A：每個基因序列長短不一，有的好幾kb，有的幾百bp，但是我們在設(shè)計引物的時候只需要要求產(chǎn)物長度80-300bp，太短或者太長都不適合做熒光定量PCR檢測。產(chǎn)物片段太短，無法跟引物二聚體區(qū)分，引物二聚體的長度大概在30-40bp，小于80bp很難區(qū)分是引物二聚體還是產(chǎn)物。產(chǎn)物片段太長，超過300bp，容易致使擴增效率低下，不能有效的檢測出該基因的量。打個比方，你在數(shù)一間教室里面有多少個人 的時候，只需要數(shù)一下有幾張嘴就可以了，在檢測基因的時候也是一樣的，只需要檢測某個基因的某一段序列來代表整個序列即可。如果你為了想數(shù)多少個人，既要數(shù)多少張嘴也要數(shù)多少個鼻子、耳朵、眼鏡，反而容易數(shù)錯。

Q：引物設(shè)計長度是多少？A：一般來說，引物長度大概在20-24bp范圍是比較好的。當然我們在設(shè)計引物的時候一定要注意引物的TM值，因為這個關(guān)系到退火溫度。經(jīng)過大量的實驗證明，60℃是一個比較好的TM值。退火溫度太低容易導致非特異性擴增，退火溫度太高一般會導致擴增效率比較低，擴增曲線起峰比較晚，CT值延后。

Q：采集樣本量的多少會不會影響實驗結(jié)果？

A：不會。很明顯，采集樣本量多，提取的RNA就比較多，cDNA就比較多， 目的片段就比較多。對于絕 對定量，要計算出某個目的片段的拷貝數(shù)，那么采集樣本量的多少肯定會影響實驗結(jié)果。比如檢測血液里面的乙肝病毒HBV，就是檢測出一定量（1ml）血液里面的HBV含量。對于科研工作中常用的相對定量，樣本量的多少與實驗結(jié)果無關(guān)，因為相對定量是指目的基因和內(nèi)參基因相比較，你可以認為它們是存在于同一核酸鏈條的上下游片段，如果樣本量多了，內(nèi)參基因和目的基因都同時等比例增加，不影響結(jié)果。