實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)概念

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR），又名定量PCR，是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。它通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR定性技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理

它的原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)

a.可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性好；

b.定量范圍寬；

c.靈敏度高；

d.特異性和可靠性更強(qiáng)，克服了假陽(yáng)性；

e.操作簡(jiǎn)單快速，無(wú) 污染，無(wú)須后處理和電泳檢測(cè)；

f.安 全，技術(shù)易于學(xué)習(xí)，易于進(jìn)行電腦化數(shù)據(jù)管理；

g.目前已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。

PCR反應(yīng)基本步驟

a.變性：通過(guò)加熱使模板DNA雙鏈之間的氫鍵斷裂，雙鏈分開(kāi)而成單鏈的過(guò)程，高溫使雙鏈DNA解離形成單鏈（94℃，30s）。

b.退火：當(dāng)溫度降低時(shí)，引物與模板DNA中互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合成雜交分子，低溫下，引物與模板DNA互補(bǔ)區(qū)結(jié)合（55℃，30s）。

c.延伸：在DNA聚合酶、dNTPs、 Mg2+存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出與模板DNA鏈互補(bǔ)的DNA子鏈，中溫延伸，DNA聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)（70-72℃，30-60s）。

以上述三個(gè)步驟為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物均可作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)過(guò)n次循環(huán)后，目的DNA以2n的形式增加。