實時熒光定量PCR步驟詳解

樣本RNA的抽提

1、取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

2、兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

3、RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

4、RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

5、RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

6、溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

RNA質(zhì)量檢測

紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度和純度。

1、濃度測定

A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(ug/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 ug/ml。具體計算如下：

RNA溶于40 ul DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

取5ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：

35 ul × 0.84 ug/ul = 29.4 ug

2、純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

變性瓊脂糖凝膠電泳測定

1、制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度 成分：

0.4M MOPS，pH 7.0

0.1M 乙酸鈉

0.01M EDTA

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 ul溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。